试剂triton中文

试剂triton中文

       现在，请允许我来为大家分享一些关于试剂triton中文的相关知识，希望我的回答可以给大家带来一些启发。关于试剂triton中文的讨论，我们开始吧。

1.在病毒提取过程中,加入triton-x100,巯基乙醇,和EDTA作用是什么?

2.核酸提取试剂中的洗脱液的作用

3.求Thermo的RevertAid First strand cDNA Synthesis kit试剂盒的中文说明书

4.塑料400多度的放热峰是什么峰

在病毒提取过程中,加入triton-x100,巯基乙醇,和EDTA作用是什么?

       Triton X100一般在阻断缓冲液中或稀释缓冲液中使用,由于存在疏水结构域,整合蛋白和膜的结合非常紧密,用此试剂可才能从膜上洗涤下来.

       巯基乙醇的作用可能有催化蛋白质完全变性和解聚,解离成亚基或单个肽链.

       EDTA能与Al3+、Fe3+、Ti4+、Mn2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等离定量作用.

       具体对病毒提取有什么作用~我也不是很清楚~你自已再想想吧!我只知道这些药品的理论.

核酸提取试剂中的洗脱液的作用

       最重要的是选择好一抗、二抗或者还有三抗，注意抗体的特异性、效价和交叉反应，最好用单抗。

       其他常用试剂有：

       1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用；

       2、清洁液、纯水，洗玻片用

       3、多聚赖氨酸处理载玻片，防止脱片

       4、固定液：4%多聚甲醛或冷丙酮等；

       5、15%~30%蔗糖，组织脱水用；

       6、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，或者OCT包埋做冰冻切片；

       7、抗原修复液：枸橼酸缓冲液（pH6.0）；

       8、活化剂：EDTA或者Triton X-100；

       9、1%~10%牛血清清蛋白（BSA）封闭液；

       10、H2O2，灭活内源性过氧化物酶；

       11、显色液：根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，免疫荧光则不需要；

       12、50%缓冲甘油封片液。

求Thermo的RevertAid First strand cDNA Synthesis kit试剂盒的中文说明书

       核酸提取试剂中的洗脱液的作用是固液分离。收集清液。即为核酸。根据核酸试剂中心文件显示。核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物。为生命的最基本物质之一。洗脱液、吸附物和待提取样品混合并反应。得到吸附有核酸的所述吸附物。所述洗脱液包括：20mmol/l～200mmol/l的nacl、10mmol/l～50mmol/l的tris、10mmol/l～50mmol/l的edta、质量百分含量为0.1％～0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2％～4％的tritonx-100、0.5mol/l～1mol/l的nabro3及0.5mol/l～1mol/l的异硫氰酸胍。及采用洗脱液处理吸附有核酸的吸附物。固液分离并收集清液。得到核酸。

塑料400多度的放热峰是什么峰

       中文如下：

       RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒

       (#K1621 10次)

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       分析许可证

       警示

       推荐第一链cDNA合成在RNAase污染被清除的条件下操作。移液器枪头和试管必须用0.1%的DEPC处理（0.1%水溶液浸泡过夜，100℃加热30min，高压灭菌）。强烈推荐戴手套。

       重要！

       -20℃保存。

       （如果长期保存对照RNA置-70℃）。

       对照RNA避免反复冻融。对照RNA融化后冰上操作。

       Lot.:1210

       保质期见包装标签.

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       试剂盒设计用来从RNA模板制备全长第一链cDNA。RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒依赖于一种遗传工程产品：低RNA酶H活性的Moloney鼠白血病病毒逆转录酶（RevertAid? M-MuLV RT）。这就允许从长模板（最大13 kb）合成全长cDNA。RevertAid? M-MuLV RT合成第一链cDNA的位置由不同引物决定：

随机六聚物引物：在RNA模板上非特异的位置，总RNA中所有RNA都是cDNA合成的模板。

oligo(dT)18：在poly(A)+ mRNA 的3’-末端。这种情况下，只有带3’-poly(A)尾的mRNA是cDNA合成的模板。

序列特异性引物：在引物结合位置。

       用这个系统合成的第一链cDNA可用做PCR*模板。因为cDNA合成和PCR的反应条件是一致的，所以cDNA反应混合物可直接加入PCR混合物。 合成的第一链cDNA也可用做第二链合成的模板。放射标记的DNA 可用做杂交探针。

       带3’-poly(A)尾的1.1 kb RNA 作为对照。

       *PCR过程为Hoffmann-La Roche, Inc.的专利涵盖。

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       试剂盒内容

       1. RevertAid? M-MuLV逆转录酶 (200u*/?l)：

       15?l酶溶解在贮存缓冲液中：50mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.1M NaCl, 1mM EDTA, 5mM DTT, 0.1% Triton? X-100和50%甘油。

       2. RiboLock? 核糖核酸酶抑制剂（20u**/?l）：

       15?l酶溶解在贮存缓冲液中：20mM HEPES-NaOH (pH 7.5), 50mM NaCl, 8mM DTT, 0.5mM ELUGENT?洗涤剂和50%甘油。

       3. 5x反应缓冲液：

       100?l 5x反应缓冲液：250mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C), 250mM KCl, 20mM MgCl2, 50mM DTT.

       4. 10mM dNTP混合物：

       30?l 10mM dGTP、dATP、dTTP、dCTP水溶液。

       5. Oligo(dT)18引物：

       15?l 0.5?g/?l (15A260 units/ml) 水溶液。

       6. 随机六聚物引物：

       15?l 0.2?g/?l (6A260 units/ml) 水溶液。

       7. 对照引物：

       15?l 10pmol/?l (1.7A260 units/ml) 17-mer水溶液。

       8. 对照RNA：

       15?l 1.1 kb带3’-poly(A)尾的1.1 kb RNA ，0.5?g/?l。

       9. DEPC处理过的水：

       2 x 1.5ml 水在deionized on a Milli-Q?装置中去离子，DEPC处理。

       * 一个单位 RevertAid? M-MuLV RT：37°C 10min内将 1 nmole dTMP结合到一个多核苷酸片段上（DE-81中吸附）。

       **一个单位 RiboLock?核糖核酸酶抑制剂：抑制5ng RNase A 50%的活性。

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       操作过程

       1. 合成适合PCR 扩增的第一链cDNA

       ① 冰上在一个管子中制备如下反应混合物：

       模板RNA*：

       总RNA 0.1-5μg

       或poly(A)+ RNA 10ng- 0.5μg

       或特异RNA 0.01pg - 0.5μg

       引物：

       oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl

       或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1μl

       或序列特异性引物 15–20pmol

       DEPC处理过的水 to 12μl

       轻柔混合，微量离心机离心3-5秒。

       ② 70°C孵育混合物5min，冰冷却，短暂离心，收集沉淀。

       ③ 管子置于冰上，按指定顺序加入以下成份：

       5x 反应缓冲液 4μl

       RiboLock?核糖核酸酶抑制剂(20u/μl) 1μl

       10mM dNTP混合物 2μl

       轻柔混合，短暂离心，收集沉淀。

       ④ 37°C孵育5min（随机六聚物引物25°C 5min）。

       *反应所需的总RNA或poly(A)+ RNA的量决定于基因的表达水平。

       ---------------------------------------------------------------------------------5

       ⑤ 加入RevertAid? M-MuLV 逆转录酶 (200u/μl) 1μl。

       终体积20μl。

       ⑥ 42°C孵育混合物60min （随机六聚物引物25°C孵育10min，最后42°C 60min）。

       ⑦ 70°C 加热10min终止反应。冰冷却。

       合成的第一链cDNA可直接用于PCR扩增。PCR 可用以下产品来完成：

       Taq DNA聚合酶（推荐）（#EP0401, #EP0402, #EP0403, #EP0404）；

       Taq DNA聚合酶（天然的，没有BSA）（#EP0281, #EP0282, #EP0283, #EP0284）;

       Taq DNA聚合酶（天然的，没有BSA）（#EP0071, #EP0072）；

       2mM dNTP 混合物（#R0241, #R0242）；

       10mM dNTP 混合物（#R0191, #R0192）。

       注意：

       1. 先从总RNA 中分离poly(A)+ RNA并不是一定需要的，但这样做可以改善终产物的收获率和纯度。

       2. RNA 样品不能被基因组DNA污染。

       3. oligo(dT)18引物不需要优化条件，而以反应中合成的cDNA平均长度来看，随机六聚物引物与RNA的比例是严格的。增加hexamer/RNA比例将导致更短的(~500 bp) cDNA更高的得率，反之降低这个比例将产生更长的产物。

       4. 增加反应温度到45°C可减轻富含GC mRNA的二级结构问题。

       5. 分析反应产物(see chapter 4) cDNA 需要[32P]放射标记。为此加入RevertAid? M-MuLV RT前加入10μCi[?-32P]dNTP (e.g., dATP) 到反应混合物中。加入1μl 0.5M EDTA 终止反应，置于冰上。

       6. 合成的cDNA应该-20°C保存。

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       2.合成适合第二链合成的第一链cDNA

       ① 冰上在一个管子中制备如下反应混合物：

       模板RNA*：

       poly(A)+ RNA 1μg

       或特异RNA 0.5 - 1μg

       引物：

       oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl

       或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1μl

       或序列特异性引物 100pmol

       DEPC处理过的水 to 12μl

       轻柔混合，微量离心机离心3-5秒。

       ② 70°C孵育混合物5min，冰冷却，短暂离心，收集沉淀。

       ③ 管子置于冰上，按指定顺序加入以下成份：

       5x 反应缓冲液 4μl

       RiboLock?核糖核酸酶抑制剂(20u/μl) 1μl

       10mM dNTP混合物 2μl

       轻柔混合，短暂离心，收集沉淀。

       ④ 37°C孵育5min（随机六聚物引物25°C 5min）。

       ⑤ 加入RevertAid? M-MuLV 逆转录酶 (200u/μl) 1μl。

       终体积20μl。

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       ⑥ 42°C孵育混合物60min （随机六聚物引物25°C孵育10min，最后42°C 60min）。

       ⑦ 70°C 加热10min终止反应。冰冷却。

       合成的第一链cDNA可用于第二链合成。合成可用以下产品来完成：

       DNA聚合酶I (#EP0041, #EP0042);

       T4 DNA连结酶(#EL0014, #EL0011, #EL0012);

       核糖核酸酶H (#EN0201, #EN0202);

       核酸酶S1 (#EN0321).

       Notes

       1. 为了增加合成的特异性和效率必须从总细胞RNA中分离poly(A)+ 片段。

       2. oligo(dT)18引物不需要优化条件，而以反应中合成的cDNA平均长度来看，随机六聚物引物与RNA的比例是严格的。增加hexamer/RNA比例将导致更短的(~500 bp) cDNA更高的得率，反之降低这个比例将产生更长的产物。

       3. 增加反应温度到45°C可减轻富含GC mRNA的二级结构问题。

       4. 分析反应产物(see chapter 4) cDNA 需要[32P]放射标记。为此加入RevertAid? M-MuLV RT前加入10μCi[?-32P]dNTP (e.g., dATP) 到反应混合物中。加入1μl 0.5M EDTA 终止反应，置于冰上。

       5. 合成的cDNA应该-20°C保存。.

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       3. 合成高比放射性的第一链

       ① 冰上在一个管子中制备如下反应混合物：

       模板RNA*：

       poly(A)+ RNA 0.5μg

       引物：

       oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl

       或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1.5μl

       或序列特异性引物 100pmol

       DEPC处理过的水 to 8μl

       轻柔混合，微量离心机离心3-5秒。

       ② 70°C孵育混合物5min，冰冷却，短暂离心，收集沉淀。

       ③ 管子置于冰上，按指定顺序加入以下成份：

       5x 反应缓冲液 4μl

       RiboLock?核糖核酸酶抑制剂(20u/μl) 1μl

       10mM dGTP, dCTP, dTTP混合物 1μl

       0.1mM dATP* 4μl

       轻柔混合，短暂离心，收集沉淀。

       ④ 37°C孵育5min（随机六聚物引物25°C 5min）。

       ⑤ 加入：

       [?-32P]dATP (10mCi/ml) 1μl

       RevertAid? M-MuLV 逆转录酶 (200u/μl) 1μl

       终体积20μl。

       * 个别的dNTP溶液不包括在这个试剂盒内。使用dNTP Set (#R0181)进行合成。.

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       ⑥ 42°C孵育混合物60min （随机六聚物引物25°C孵育10min，最后42°C 60min）。

       ⑦ 加入5μl 0.5M EDTA终止反应。

       ⑧ 如果需要，加入等体积(25μl)0.6N NaOH水解RNA，70°C孵育30min。

       ⑨ 在Sephadex? G-50柱上层析法移除未结合dNTPs。

       用这种方法获得的高特异活性第一链cDNA (>107 dpm/μg)可用做Southern中的杂交探针。

       注意：

       为了获得更高特异活性 (over 108dpm/μg) 的cDNA，加入100μCi of [?-32P]dATP到反应混合物中。如果最终的反应体系大于20μl，在分离管中真空蒸发10μl [?-32P]dATP (10mCi/ml)并转移制备的反应混合物到这个管子中 (5 step)。然后继续合成。

       4. 分析第一链cDNA产物

       仅放射标记的cDNA产物可以用碱性琼脂糖凝胶电泳鉴定或分析。

       测定第一链cDNA的得率

       ① 点1μl样品到两张DE-81滤膜(1.5x1.5cm)。

       ② 烤灯烤干滤膜。保留一张滤膜，直接用于测定样品总放射活性。

       ③ 另一张滤膜在10ml 7.5% (w/v)Na2HPO4 x12H2O中洗涤三次5min；水漂洗，丙酮或96%乙醇洗。

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       ④ 烤灯烤干洗过的滤膜。

       ⑤ 转移两张滤膜（未洗和已洗的）到放射活性计数器内并计数。

       ⑥ 用以下公式计算第一链cDNA得率：

       如果dNTP终浓度是1.0mM，那么测定(20μl)中mol dATP是2x10-8 mol。标记的dATP数量是相当低的，所以可忽略。然而，在高特异活性的cDNA时(chapter 3)，未标记dATP的终浓度是0.02mM。为了测量中mol dATP的计算，需要总计未标记和标记的摩尔数。

       MW 是核酸的平均分子量，等于333x106 μg/mol。因为所有四种dNTP都参加反应，所以MW 乘了4。

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       例如：For example:

       如果水洗滤膜产生4x104dpm，未水洗滤膜产生1.8x106dpm；

       那么：

       cDNA yield (μg) = 4x104dpm x (2x10-8mol dATP) x 4 x (333x106μg/mol) = 0.59μg

        1.8x106dpm

       cDNA yield % = 0.59μg x 100% = 59%

        1μg

       碱性琼脂糖凝胶电泳分析

       标记[32P] 的第一链cDNA合成产物可以用碱性琼脂糖凝胶电泳分析。同样，合成产物和所用的DNA marker 都要[32P]标记。

       ① 制备1.4% 琼脂糖凝胶（30mM NaCl, 2mM EDTA），在碱性电泳缓冲液(30mM NaOH, 2mM EDTA)平衡至少1h。

       ② 标本抽样(1x105 dpm)，转移到一个单独的管子中，5μl水稀释。加入5μl 2x loading buffer

       (60mM NaOH, 2mM EDTA, 6% Ficoll? 400, 0.05% bromophenol blue)。标记的DNA marker应该用同样的2xloading buffer稀释。

       注意. 2x loading buffer应该保存在-20°C，或染料应该使用前才加。

       ③ 加入样品，在碱性琼脂糖凝胶中5V/cm电泳，到染料泳动到接近凝胶2/3的位置处中止。

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       ④ 凝胶浸没在7% 三氯醋酸 (TCA)中，室温30min。

       ⑤ 干胶器上真空干燥凝胶，或玻璃板加压的多层纸巾下干燥1-2 hours。

       ⑥ 干燥的凝胶覆盖在塑料封皮下，室温X-ray胶片室温暴光过夜。

       对照的合成

       提供带3’-poly(A)尾的1.1 kb RNA 作为对照。

       ① 冰上在一个管子中制备如下反应混合物：

       模板RNA*：

       对照 RNA 0.5μg

       引物：

       oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl

       或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1μl

       或对照（序列特异性）引物(10pmol) 2μl

       DEPC处理过的水 to 11μl

       轻柔混合，微量离心机离心3-5秒。

       ② 70°C孵育混合物5min，冰冷却，短暂离心，收集沉淀。

       ③ 管子置于冰上，按指定顺序加入以下成份：

       5x 反应缓冲液 4μl

       10mM dNTP 混合物 2μl

       RiboLock?核糖核酸酶抑制剂(20u/μl) 1μl

       轻柔混合，短暂离心，收集沉淀。

       ④ 37°C孵育5min（随机六聚物引物25°C 5min）。

       ⑤ 加入：

       [?-32P]dATP (10mCi/ml) 1μl

       RevertAid? M-MuLV 逆转录酶 (200u/μl) 1μl

       终体积20μl。

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       ⑥ 42°C孵育混合物60min （随机六聚物引物25°C孵育10min，最后42°C 60min）。

       ⑦ 加入1μl 0.5M EDTA终止反应，置于冰上。

       ⑧ 分析产物(see chapter 4)。

       注意：

       1. 使用对照RNA时第一链cDNA的得率常大于50%。

       2. 如果用oligo(dT)18或对照（序列特异性）引物合成对照– 可以观察到一个清楚的1.1 kb 条带。如果用随机六聚物引物，通常可观察到几个短的条带。

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       常见问题

       低得率、没有可检测到的产物是逆转录酶反应失败的两个清楚标志。

       可能原因 检查 补救

       DNA模板降解。 用乙二醛、甲醛凝胶电泳检查RNA模板完整性。对照RNA在凝胶中应该可见一条明亮的1.1kb带。 操作样品RNA时，要小心不要被RNases污染。-70°C保存模板RNA和对照RNA，避免避免反复冻融样品，融化后置于冰上。

       RNase污染反应 混合物。 使用对照并分析所得产物(见对照的合成)。 无菌状态下制备反应混合物，始终戴手套，用DEPC 处理所有接触样品的器皿。主要不要污染溶液。

       RevertAid? M-MuLV逆转录酶抑制剂(SDS, EDTA, 胍盐, 磷酸盐, 焦磷酸盐, 多胺, 精胺, 精脒)。 在RNA样品中混入1μg对照RNA，同时合成。如果用oligo(dT)18或对照引物，合成的得率应该大于50%，可见到一明亮的1.1kb附加条带。 96%乙醇沉淀RNA样品，75%乙醇洗涤 (制备乙醇溶液应使用DEPC处理过的水). 不要加抑制剂到反应混合物中。

       不适当的引物 用其他的引物进行，分析产物。 序列特异性引物应该与RNA 3’-末端互补。如果If the RNA模板包含转录间歇，使用随机六聚物引物合成。

       合成的第一链cDNA序列错误。 重复合成cDNA。

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       质量控制

       试剂盒的所有试剂都通过用一个多腺苷酸RNA转录本作为对照模板(特异的对照引物、oligo(dT)18、随机六聚物引物)进行第一链cDNA合成反应来检测。.

       质量核定: Birute Gagiliene

       塑料400多度的放热峰是塑料峰。

       塑料峰是指谱图中显示的相差44Da，并规律呈现的峰，它是一类杂质峰的统称，会掩盖低丰度蛋白的峰，造成鉴定蛋白不全且数据具有偏性。这些

       塑料峰可能是Triton X-100（去垢剂）的峰，也可能是EP管等塑料器皿内壁渗滤出的polymer（-CH2CHOH-）的峰。因此，我们建议在样品制备过程中不可采用含有Triton X-100等去垢剂的试剂，需带无粉乳胶手套，在玻璃板上进行切割胶条的工作，并用高质量的进口EP管盛装样品。

       好了，今天关于“试剂triton中文”的话题就讲到这里了。希望大家能够通过我的讲解对“试剂triton中文”有更全面、深入的了解，并且能够在今后的学习中更好地运用所学知识。